由于農(nóng)業(yè)施肥的不合理使用和生活污水、工業(yè)污水、養(yǎng)殖污水、農(nóng)田徑流的直接排放，大量氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)被排入自然水體，對水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，污水處理廠被認(rèn)為在控制污染和改善水質(zhì)方面起著舉足輕重的作用。然而，經(jīng)過生物處理后的污水處理廠廢液中仍有約10-15 mgL?1的氮殘留，如果不經(jīng)任何深度處理直接排放，可能導(dǎo)致富營養(yǎng)化。因此，迫切需要有效的污水處理廠廢液深度脫氮技術(shù)。本文以新型生物高分子3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物（PHBV）和PHBV-鋸末共混合體為載體，構(gòu)建了固相反硝化系統(tǒng)，通過中試試驗對污水處理廠（WWTPs）廢液進行深度脫氮，并通過宏基因組測序分析共混物碳源對微生物群落結(jié)構(gòu)、功能和代謝途徑的影響。與PHBV系統(tǒng)相比，PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的反硝化處理效果更優(yōu)：NO3?-N去除率更高（96.58%）、DOC釋放量（9.00±4.16 mgL?1）和NH4+-N積累量（0.37±0.32 mgL?1）更低。宏基因組分析證實了兩個系統(tǒng)間微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，并發(fā)現(xiàn)了四種厭氧氨氧化菌的存在。與PHBV系統(tǒng)相比，PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的利用降低了產(chǎn)NH4+-N相關(guān)酶編碼基因的相對豐度，增加了參與厭氧氨氧化相關(guān)酶編碼基因的相對豐度，這有助于降低廢液中的NH4+-N的含量。另外，在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，產(chǎn)生電子的糖酵解代謝過程的酶編碼基因的相對豐度更高。在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，多種木質(zhì)纖維素酶編碼基因顯著富集，保證了該系統(tǒng)的穩(wěn)定供碳和連續(xù)運行。本研究結(jié)果有望為固相反硝化技術(shù)的推廣提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

論文ID

原名：Metagenomic analyses of microbial structure and metabolic pathway in solid-phase denitrification systems for advanced nitrogen removal of waste water treatment plant effluent: Apilot-scale study

譯名：固相反硝化系統(tǒng)中微生物結(jié)構(gòu)及代謝途徑的宏基因組分析：基于污水處理廠廢水深度脫氮的中試研究

期刊：Water Research

IF：9.130

發(fā)表時間：2021.3.17

通訊作者：吳為中

通訊作者單位：北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)系

實驗設(shè)計

本研究在寧波南區(qū)污水處理廠，以PHBV和PHBV-鋸末共混合物為生物膜載體和碳源，構(gòu)建固相反硝化系統(tǒng)。具體構(gòu)建方法為：PHBV和PHBV-鋸末共混合體分別與8-10 mm的陶粒以3:7的體積比混合均勻，將混合后的基質(zhì)填充于高100 cm的多孔支撐盤上，以此建立了兩個直徑20 cm、高140 cm的圓柱形聚氯乙烯固相反硝化系統(tǒng)。該系統(tǒng)啟動階段，將污水處理廠廢液與二沉池活性污泥混合后，以1:1的體積比進入固相反硝化系統(tǒng)，進行生物膜培養(yǎng)。之后每天對固相反硝化系統(tǒng)的水質(zhì)進行分析，5天后，廢液中的NH4⁺-N和NO3^?-N濃度分別低于1.0和2.0 mgL^?1時，標(biāo)志著固相反硝化系統(tǒng)正式啟動。該系統(tǒng)共計連續(xù)運行150天，1-76天固相脫氮系統(tǒng)的水力停留時間（HRT）為3h，77-150天將HRT降至1.5h，以評估脫氮性能的持久性。測得污水處理廠廢液的溶解氧（DO）和pH值分別為4.1-8.0 mgL^?1和5.68-6.95。

每兩天采集一次進水和出水水樣。通過0.45μm醋酸纖維素膜過濾后，分別對水樣中的NH4⁺-N、NO3^?-N、NO2^?-N、溶解有機碳（DOC）等水質(zhì)指標(biāo)進行分析。

在系統(tǒng)穩(wěn)定運行150天時，分別從PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中的5個采樣點采集生物膜樣品，每個采樣點取2g均勻混合成一個樣本，分別命名為P和PS。每個樣本有三個生物學(xué)重復(fù)。提取相應(yīng)樣品的DNA進行宏基因組測序及分析，以進行微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝途徑的研究。

結(jié)果與討論

1不同系統(tǒng)的最佳脫氮性能

不同HRT下的脫氮和DOC釋放性能見表1。HRT為3h和1.5h下，進水中的NO3^?-N的平均濃度分別為9.53±1.43mgL^?1和9.94±1.17 mgL^?1，僅檢測到少量NH4⁺-N。HRT為3h時，PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的去除率分別為92.36%和96.64%。在PHBV中摻入鋸末，提高了其硝酸鹽的去除率，改善了其生物可利用率，有利于微生物的附著和固體有機碳的生物降解。

相較于PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)，PHBV系統(tǒng)的DOC和NH4⁺-N濃度更高。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的DOC平均濃度為15.49±12.09 mgL^?1，HRT調(diào)整至1.5 h后降至9.00±4.16 mgL^?1。HRT調(diào)整到1.5h后，PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)仍然保持了95.57%和96.58%的有效NO3^?-N去除率，表明了固相反硝化系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)出水中NH4⁺-N的累積濃度降至0.37±0.32 mgL^?1，遠(yuǎn)低于PHBV系統(tǒng)（1.14±0.37 mgL^?1）。

表1. 不同HRT下的固相反硝化系統(tǒng)的脫氮性能

2不同固體碳源對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過宏基因組測序，樣品分組

P得到的原始數(shù)據(jù)量為3.96×10¹⁰raw bases和2.62×10⁸raw reads，樣品分組PS得到的原始數(shù)據(jù)量為3.75×10¹⁰raw bases 和2.49×10⁸raw reads。NR物種注釋結(jié)果顯示：細(xì)菌占總物種的97.53%-99.06%，在每個樣本中均占優(yōu)勢。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中細(xì)菌和病毒的比例顯著低于PHBV系統(tǒng)，而古菌和真核生物的比例在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中則具有明顯的數(shù)量優(yōu)勢。

PHBV系統(tǒng)和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中相對豐度大于1.00%的主要門如圖1a所示。分析表明兩個系統(tǒng)在門水平上的微生物群落組成存在顯著差異。兩個系統(tǒng)中均以變形菌門（Proteobacteria）為主，分別占78.96%和50.05%。在PHBV系統(tǒng)中，擬桿菌門（Bacteroidetes）為第二優(yōu)勢菌門（3.63%），其次為厚壁菌門（Firmicutes）（3.27%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（2.87%）、放線菌門（Actinobacteria）（1.37%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（1.24%）和Spirochaetae（1.19%）。在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，放線菌門（Actinobacteria）是的第二優(yōu)勢菌門（10.61%），其次是綠彎菌門（Chloroflexi）（7.36%）、擬桿菌（Bacteroidetes）（5.33%）、浮霉菌門(Planctomycetes)（2.73%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（2.65%）、厚壁菌門（Firmicutes）（2.34%）、Ignavibacteriae（2.04%）、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)（2.07%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（1.33%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（1.40%）和廣古菌門(Euryarchaeota)（1.36%）。變形菌、擬桿菌、放線菌和綠彎菌廣泛存在于城市污水處理系統(tǒng)中，在生物降解中起著重要作用。大多數(shù)脫氮細(xì)菌隸屬于變形菌門，變形菌在反硝化中起著主導(dǎo)作用。放線菌合成的一些酶可以促進植物生物量中多糖或酚類化合物的分解過程。綠彎菌和擬桿菌被認(rèn)為具有分解大分子的能力，通常在發(fā)酵系統(tǒng)中觀察到。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中綠彎菌、放線菌和擬桿菌的豐度較高，可能是由于生物量的難降解性所致。值得一提的是，在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中檢測到廣古菌門，相對豐度為1.36%。玉米秸稈和雞糞中溫發(fā)酵系統(tǒng)中主要的菌群是廣古菌、擬桿菌和厚壁菌。此外，廣古菌門含有豐富多樣的產(chǎn)甲烷細(xì)菌，它們在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)生甲烷。因此，在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，一小部分有機物可能通過厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化為甲烷，而不是進行反硝化作用。

PHBV系統(tǒng)和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)在屬水平上的微生物群落組成如圖1b所示。在PHBV系統(tǒng)中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）所占比例最高，達(dá)36.91%，其次是脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（3.82%）、趨磁螺旋菌屬（Magnetospirillum）（2.90%）、Azoarcus（1.56%）、地桿菌屬（Geobacter）（1.20%）、Thaurea（1.19%）、Azonexus（1.16%）和Candidatus Accumulibacter（1.08%）。在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）的數(shù)量最多，占3.00%，其次是Sulfuritalea（2.64%）、緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（1.96%）、Ignavibacterium（1.81%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）（1.51%）、Candidatus Accumulibacter（1.46%）、Conexibacter（1.31%）和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）（1.23%）。脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）,Thauera,Ignavibacterium和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）能夠代謝氮和芳香化合物，這在污水處理系統(tǒng)中很常見。脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）是固相反硝化菌，可以利用木質(zhì)纖維素作為碳源。脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）普遍存在于厭氧系統(tǒng)中，能夠參與DNRA。

圖1. PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)在門（a）和屬（b）水平上的微生物組成。

PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中微生物組成的差異分析如圖2所示。在前15個門中，只有變形桿菌門（Proteobacteria）和Spirochaetae在PHBV系統(tǒng)中的相對豐度顯著較高，而其他門主要分布在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中。前15個屬中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）, 脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）, 趨磁螺旋菌屬（Magnetospirillum）,Azoarcus, 地桿菌屬（Geobacter）和假單胞菌屬(Pseudomonos)在PHBV系統(tǒng)中顯著富集。

圖2. PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)在門（a）和屬（b）水平上微生物組成的差異分析。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

之前的研究表明，PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中nirS和amx基因有明顯的富集，因此推測該系統(tǒng)中反硝化和厭氧氨氧化可能有共存的現(xiàn)象，這有助于更好地控制氮和溶解有機碳的含量。在本研究中，NR物種注釋的結(jié)果表明PHBV和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中存在厭氧氨氧化細(xì)菌，包括CandidatusBrocadia,Candidatus Kuenenia,Candidatus Scalindua和CandidatusJettenia（圖3）。在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，CandidatusBrocadia是相對豐度最高（0.09%）的一種厭氧氨氧化菌，而其他厭氧氨氧化細(xì)菌的相對豐度較低（約為0.03%）。此外，所有檢測到的厭氧氨氧化菌在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中的相對豐度明顯高于PHBV系統(tǒng)，證實了反硝化作用與厭氧氨氧化的協(xié)同作用，PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中的厭氧氨氧化活性更高，有利于降低系統(tǒng)出水中累積的NH4⁺-N。

圖3. PHBV與PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中厭氧氨氧化細(xì)菌豐度的差異分析。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

3不同固體碳源對氮代謝和糖酵解途徑的影響

氮代謝相關(guān)酶編碼基因的相對豐度如圖

4所示。在反硝化途徑中，編碼硝酸還原酶（EC 1.7.5.1）、一氧化氮還原酶（EC 1.7.2.5）和一氧化二氮還原酶（EC 1.7.2.4）的基因在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中的相對豐度顯著較高，表明其對硝酸鹽的去除效果較好，與出水中較低的NO3?-N相一致。PHBV系統(tǒng)中編碼NH4+-N生成的基因固氮酶（EC1.18.6.1）和羥胺還原酶（EC1.7.99.1）基因相對豐度顯著增加，導(dǎo)致出水中NH4+-N的積累。在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)厭氧氨氧化的肼合酶（EC 1.7.2.7）和肼脫氫酶（EC 1.7.2.8）編碼基因的相對豐度顯著高于PHBV系統(tǒng)，調(diào)節(jié)NH4+-N生成的編碼基因豐度相對減少，而調(diào)節(jié)厭氧氨氧化作用的編碼基因豐度相對增加，最終導(dǎo)致出水中NH4+-N的積累減少。

圖4. 氮代謝和糖酵解關(guān)鍵酶編碼基因的相對豐度。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

反硝化微生物通過降解碳源獲得電子，保證NO3^?-N完全還原為N2。在糖酵解過程中，葡萄糖激酶（GK，EC 2.7.1.2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，EC 1.2.1.59）是催化產(chǎn)生反硝化電子供體的兩種重要酶。在糖酵解代謝途徑中，編碼葡萄糖激酶的基因在PHBV系統(tǒng)中的相對豐度（2.73%）顯著高于PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的（2.47%）。葡萄糖激酶負(fù)責(zé)催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，這是碳源代謝的第一步。當(dāng)固體碳源水解速率過快時，這可能會加速碳源的水解，并導(dǎo)致PHBV系統(tǒng)出水的DOC升高（表1）。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)GAPDH編碼基因相對豐度（EC 1.2.1.59）為0.18%，顯著高于PHBV系統(tǒng)的（0.04%）。GAPDH可催化糖酵解過程中甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酯，并生成NADH，作為微生物反硝化的電子供體。因此，在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，為硝酸鹽的去除提供更多的電子供體，這與PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)具有更好的硝酸鹽去除性能相一致。

而PHBV系統(tǒng)中磷酸甘油激酶（EC 2.7.2.3）和丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）編碼基因的相對豐度（分別為3.49%和3.63%）明顯高于PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)的（分別為2.64%和3.39%）。作為催化ATP生成的關(guān)鍵酶，其編碼基因的相對豐度明顯較高，可能為PHBV系統(tǒng)中的微生物硝化作用提供更多有效的ATP，而固相反硝化系統(tǒng)中相對較低的DO抑制了微生物硝化作用。

微生物反硝化需要足夠的電子來完成硝酸鹽異化還原為氮的過程。PHBV-鋸末共混物的利用保證了NADH的供應(yīng)，為微生物脫氮提供了足夠的電子。而PHBV系統(tǒng)出水DOC濃度升高，促進了DNRA生物的生長，但抑制了厭氧氨氧化菌的繁殖，并導(dǎo)致出水中NH4⁺-N的積累。

4不同系統(tǒng)中注釋的木質(zhì)纖維素酶

PHBV系統(tǒng)和PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中注釋的木質(zhì)纖維素酶的相對豐度及其差異分析如圖5所示。分別對兩個系統(tǒng)中的10種木質(zhì)纖維素酶進行了注釋，包括5種纖維素酶（β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、α-葡萄糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶和纖維素1,4-β-纖維二糖苷酶）、4種半纖維素酶（β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶）、1種木質(zhì)素水解酶（半乳糖氧化酶）。除纖維二糖磷酸化酶和半乳糖氧化酶外，大部分木質(zhì)纖維素酶顯著富集在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中。表明該系統(tǒng)中木質(zhì)纖維素的降解更加活躍，不僅提高了資源利用率，而且防止了固相反硝化系統(tǒng)的堵塞，保證了異養(yǎng)反硝化反應(yīng)穩(wěn)定的碳源供應(yīng)。

圖5. PHBV與PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中注釋的木質(zhì)纖維素酶的相對豐度及其差異。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

結(jié)論

以PHBV-鋸末共混物為載體的中試規(guī)模的固相脫氮系統(tǒng)成功地實現(xiàn)了污水處理廠廢液的深度脫氮，其負(fù)面影響小于PHBV系統(tǒng)。宏基因組分析表明，在PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)NH4⁺-N產(chǎn)生的編碼基因豐度相對減少，而調(diào)節(jié)厭氧氨氧化作用的編碼基因豐度相對增加，最終導(dǎo)致系統(tǒng)出水中NH4⁺-N積累減少。與PHBV相比，PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中GAPDH（EC 1.2.1.59）編碼基因的相對親和力顯著提高，促進了微生物的反硝化作用。PHBV-鋸末共混物系統(tǒng)中木質(zhì)纖維素酶編碼基因的顯著富集表明木質(zhì)纖維素酶的降解更為活躍，從而保證了碳源的持久供應(yīng)和固相反硝化系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。本研究首次以PHBV-鋸末共混物為載體構(gòu)建固體反硝化系統(tǒng)，通過中試試驗對污水處理廠廢液進行深度脫氮，并對該系統(tǒng)中微生物代謝機理進行了研究，為天然生物材料的高效利用以及生物共混合碳源對氮代謝的影響提供了新的思路。

原標(biāo)題：北大 | Water Research：固相反硝化系統(tǒng)中微生物結(jié)構(gòu)及代謝途徑的宏基因組分析：基于污水處理廠廢水深度脫氮的中試研究

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